Механизм мутаций генома иммуноглобулинов

Авторская работа Автор: Сергей Яковлев Рецензия: от Goga312 (не законченно)

Гены антител (имунноглобулина) отличаются от всех остальных генов. По сути даже нельзя говорить о едином гене иммуноглобулина (Ig), так как этот белок состоит из различных доменов. Его составляющие вариабельные (V-) и константные (C-) участки лёгких цепей иммуноглобулинов (L) отделены друг от друга участком последовательности ДНК (≈ 300 тыс. оснований), а тяжёлые цепи иммуноглобулинов (H) могут находится вообще на другой хромосоме. Для чего такое сложное устройство ? Ответить на это нам поможет рассмотрение нескольких связанных процессов.

Вкратце процесс созревания B-лимфоцита следующий. Часть Ig-локуса, то есть места локализации «Ig-гена» в ДНК, содержит в «зародышевой линии» большое число (сотни) V-генов. В каждой отдельной клетке лимфоцита происходит вначале V(D)J рекомбинация, а затем альтернативный сплайсинг мРНК, в результате которого взаимное расположение нуклеотидов в мРНК не совпадает с их расположением в ДНК.

Далее запускается другой процесс в органах иммунной системы при встрече организма с новым антигеном. С помощью фермента обратной транскриптазы происходит обратная транскрипция. Из молекулы мРНК, синтезируется цепочка ДНК, новосинтезированная цепь замещает соответствующий ей участок в оригинальной ДНК, ингибируя таким образом второй нативный участок цепи. В результате этого процесса лимфоцит изменяет участок генома: один из V-генов передвигается и становится рядом с одним из несколько возможных C-генов. Этот участок отвечает за синтез антител, что позволяет добиться вариабельности структуры антител превышающей запрограммированную в геноме.

Теперь рассмотрим несколько детальнее. Случайное перемещение только одного V-участка из большого числа возможных приводит к тому, что клетка производит антитела только одной специфичности. После такой случайной перестройки H- и L- цепей, клетка из большого числа возможных комбинаций H+L белковых цепей создает один полный белок. Затем клетка экспресирует это антитело на поверхности, и ее судьба решается окончательно: если она окажется «против своих», она будет уничтожена , иначе станет потенциальным участником иммунного ответа на чужие антигены.

О генах антител в неперестроенном виде говорят, что они имеют «конфигурацию зародышевой линии». В таком виде находится ДНК в половых клетках (сперматозоидах и яйцеклетках) и во всех клетках организма, кроме зрелых лимфоцитов (в клетках печени, почек, поджелудочной железы, в других лимфоцитах, например, в фагоцитах). В каждом созревающем лимфоците мыши и человека ДНК подвергается случайной специфической соматической рекомбинации. Это может чем то напоминать мутацию, но имеет принципиально другую природу нежели хромосомные мутации. Её механизм вкратце следующий:

Упрощённая схема of V(D)J рекомбинации

1. В конфигурации зародышевой линии ряд очень похожих (но все-таки различных) вариабельных V-элементов лежит выше (левее) экзонов, кодирующих константную С-область. Эти V-элементы, кодирующие примерно 95 аминокислот, называются неперестроенными. Между V- и С- элементами расположены D- и J-элементы, каждый кодирует короткую последовательность аминокислот. Каждый V-элемент имеет лидерную (L) последовательность, которая кодирует короткую последовательность аминокислот, сигнальный пептид. Также существует лидерный L-V-интрон между L и V элементами
2. В ходе развития В-клеток в костном мозге в каждом В-лимфоците случайно перестраиваются V-, D- и J-элементы тяжелой цепи, и появляется перестроенная последовательность вариабельной области VDJ — соматическая конфигурация. Данная перестройка происходит при синтезе М-РНК, из которой в послествии будет транскрибирована новая ДНК последовательность. Для Н-цепей на первом этапе перестройки происходит объединение DJ, за ним следует объединение с V-элементом, и образование VDJ. После перестройки вся ДНК между случайно выбранным V-элементом и использованным J-элементом удаляется из клетки. То есть заменяются только определенные конкретные участки цепи, а не вся линейная последовательность. Таким образом, каждая успешная перестройка ДНК вариабельной области уникальна для каждой зрелой В-клетки. Про-мРНК, содержащая вариабельный (VDJ) участок, присоединенный к С-участку, образуется в ядре. L-V и J-C интроны и интроны внутри С -участка затем вырезаются, что приводит к экспорту зрелой РНК молекулы в цитоплазму, где она транслируется на рибосоме в последовательность аминокислот. Лидерный (сигнальный) пептид отрезается от белка, когда он выделяется из клетки. Соматическая конфигурация и конфигурация зародышевой линии генов L-цепей такая же, кроме того, что легкие цепи не содержат D-участков.
3. Перестройки ДНК выполняются набором особых рекомбинационных ферментов. Кодирующие их гены называются генами, активирующими рекомбинацию (recombination activating genes — RAG), и локализованы в других местах генома. RAG-ферменты распознают ДНК-последовательности сигнальных последовательностей на соответствующих концах V-, D- и J-элементов, которые и соединяются.

Теперь можно ответить на вопрос — почему В-лимфоцит производит антитела только одной специфичности? Все соматические клетки (клетки тела) имеют двойной набор хромосом, один набор от матери, другой от отца. Такие клетки называются диплоидными. Сперматозоиды и яйцеклетки имеют только по одному набору хромосом (они гаплоидны). Оплодотворение, слияние сперматозоида и яйцеклетки, восстанавливает диплоидное состояние. Кроме половых хромосом (X и Y), все другие хромосомы диплоидного набора разбиваются на пары с очень похожими ДНК-последовательностями. По мере созревания В-лимфоцита начинается перестройка V-, D- и J-элементов. Успешная V(D)J-перестройка в одной хромосоме посылает сигнал, который выключает активность RAG-ферментов и препятствует перестройке в гомологичной хромосоме.

Еще важный вопрос — почему рекомбинация (перестройка) ограничивается V(D)J-участком ? Если перестройки в вариабельной области антитела могут оказаться полезными, то перестройки в константной области, скорее всего, вредны, так как они могут нарушить эффекторные функции антитела, запуск лизиса бактериальных клеток или стимулирование фагоцитоза. Разделение V- и С-участков позволило эволюции создать механизм, который обеспечивает перестройки в V-участке, но сохраняет С-участок неизменным.

Далее перестроенный V(D)J-ген может подвергаться очень высокому уровню соматических мутаций, и новое антитело оценивается по способности связывать антиген. Антитела с самой высокой аффинностью к чужеродному антигену выигрывают в отборочных соревнованиях за связывание антигена, сохраняются и становятся долго живущими клетками памяти. В-лимфоцит проиграет соревнование, если мутация уменьшает или уничтожает аффинность; такие клетки погибают. В-лимфоциты, кодирующие антитела, которые связывают собственные антигены, также уничтожаются, и, следовательно, сохраняется аутотолерантность.

Высокий уровень ошибок при образовании РНК по матрице ДНК (транскрипции) и при образовании ДНК по матрице РНК (обратной транскрипции) характеризуются частотой точковых мутаций 10⁻³—10⁻⁴, что существенно выше, чем частота ошибок при репликации ДНК (от 10⁻⁸ до 10⁻⁹). Неточность, большое число ошибок имеют место и при репликации генома РНК-содержащих вирусов, например, вируса гриппа. Этим объясняется быстрое генетическое изменение вируса, приводящее к пандемиям гриппа. Таким образом, все процессы копирования, включающие одноцепочечные РНК-посредники (превращение РНК в ДНК и наоборот), идут с большим числом ошибок, при этом репарация последовательности невозможна, поскольку ферменты, осуществляющие такое неточное копирование полинуклеотидов (РНК-полимераза, обратная транс -криптаза и РНК-репликаза), как оказалось, не имеют функций проверки и исправления ошибок.

Мутации, которые передаются потомкам, появляются с низкой частотой. Они возникают в половых клетках и называются генеративными. Это редкие ошибки, которым удалось ускользнуть от «проверок» ДНК-полимеразы во время репликации ДНК и упаковки ее в сперматозоиды и яйцеклетки. Они могут вызывать дефекты (то есть влиять на фенотип и состояние здоровья индивида). Однако существуют варианты некоторых генов (альтернативные формы генов называют аллелями), которые не влияют на здоровье индивида, у которого они проявляются.

Поэтому соматические мутации небольшого начального набора V-генов зародышевой линии происходят до передачи информации V-генов от сомы к зародышевой линии. А молекулярной машиной при этом является RT-обратная транскриптаза, которая с высокой частотой вызывает соматические перестройки ДНК VDJ-гена. Эта RT-обратная транскриптаза использует про-мРНК как матрицу для синтеза кДНК (созданной обратной транскриптазой на основе РНК).

Теперь выясним, что является сигналом к прекращению соматического мутирования? Точнее, Каков механизм предотвращения лишних, портящих успешно отобранную последовательность, мутаций?

Селективное преимущество состоит в том, что когда антитело в центре размножения изменится настолько, что будет обладать высокой аффинностью к антигену, В-клетке должен быть дан сигнал остановить дальнейшее мутирование. Тогда мутаций не будет слишком много, и риск потери высокой аффинности к антигену будет минимизирован. Сигналом может быть прекращение производства белковых субъединиц RT-мутаторсомы (белки постоянно разрушаются ферментами, называемыми протеазами. Следовательно, они исчезают до тех пор, пока не начнется новый синтез).

А что если этот механизм мутирования влияет на видообразование ?